1.本发明涉及基因工程领域，具体而言，成核肠杆程菌涉及一种从头合成核黄素的黄素大肠杆菌工程菌的构建方法。


背景技术：

2.核黄素是大的构8种b族维生素成员之一，它为哺乳动物的菌工建方必需营养物质。在最近15年时间内，头合化学合成核黄素完全被微生物合成所替代，成核肠杆程菌目前发酵工业上的黄素主要生产菌株为枯草杆菌和棉囊阿舒氏酵母。
3.近年来，大的构国内农产品以及各种化工原材料价格明显上涨，菌工建方人力、头合环保等多种开支也呈增长趋势，成核肠杆程菌造成核黄素生产成本不断上升。黄素因此，大的构进一步改良核黄素生产菌种，菌工建方降低发酵生产成本已成当务之急。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种从头合成核黄素的大肠杆菌工程菌的构建方法，解决背景提出所提出的至少一个技术问题。
5.一种从头合成核黄素的大肠杆菌工程菌的构建方法，所述方法包括：
6.对来自枯草芽孢杆菌的26个合成核黄素的基因进行结构优化，并化学合成，获得了优化后的26个基因；
7.选择t7启动子和终止子控制所述优化后的26个基因的表达，完成优化后的26个基因原核表达单元的拼接；
8.构建了两个不同复制起点和抗性标记的质粒pbr326和pyb8895，在两个相容质粒基础上组装了核黄素从头生物合成途径4大功能模块；
9.将带有4大功能模块的双质粒转入带有t7rnap基因的大肠杆菌，获得了从头合成核黄素的含枯草杆菌26个基因原核表达单元的大肠杆菌工程菌株。
10.优选的，所述枯草芽孢杆菌的26个合成核黄素的基因为：bsglk1、bszwf1、bspgl、bsgnd、bsywlf、bsprs、bspurf、bspurd、bspurn、bspurl、bspurq、bspurs、bspurm、bspurk、bspure、bspurc、bspurb、bspurh、bsguaa、bsguab、bsgmpk、bsndk、bsriba、bsribb、bsribg和bsribh；
11.其序列号分别对应为：seq id no 1、seq id no 3、seq id no 5、seq id no 7、seq id no 9、seq id no 11、seq id no 13、seq id no 15、seq id no 17、seq id no 19、seq id no 21、seq id no 23、seq id no 25、seq id no 27、seq id no 29、seq id no 31、seq id no 33、seq id no 35、seq id no 37、seq id no 39、seq id no 41、seq id no 43、seq id no 45、seq id no 47、seq id no 49、seq id no 51；
12.优先的，所述枯草芽孢杆菌的26个合成核黄素的基因按密码子偏好性进行结构优化。
13.优先的，所述优化后的26个基因为：
14.bsglk1 s、bszwf1s、bspgls、bsgnds、bsywlfs、bsprss、bspurfs、bspurds、bspurns、bspurls、bspurqs、bspurss、bspurms、bspurks、bspures、bspurcs、bspurbs、bspurhs、bsguaas、bsguabs、bsgmpks、bsndks、bsribas、bsribbs、bsribgs和bsribhs；
15.其序列号分别对应为：seq id no 2、seq id no 4、seq id no 6、seq id no 8、seq id no 10、seq id no 12、seq id no 14、seq id no 16、seq id no 18、seq id no 20、seq id no 22、seq id no 24、seq id no 26、seq id no 28、seq id no 30、seq id no 32、seq id no 34、seq id no 36、seq id no 38、seq id no 40、seq id no 42、seq id no 44、seq id no 46、seq id no 48、seq id no 50、seq id no 52。
16.优先的，所述4大功能模块，包括：核酮糖-5-磷酸生物合成、次黄嘌呤核苷酸生物合成、gtp生物合成和核黄素rib生物合成。
17.优先的，构建了两个不同复制起点和抗性标记的质粒pbr326和pyb8895两个相容性质粒为：选择pbr322 ori和广宿主pbbr1mcs质粒ori的两种载体。
18.优先的，所述构建方法还包括验证所转入的外源基因的完整性和表达，以及检验其生成核黄素的能力。
19.技术效果：
20.本发明对枯草杆菌核黄素从头生物合成途径的26个基因进行结构优化和化学合成，创制了含有4个功能模块和26个基因原核表达单元的大肠杆菌工程菌，最后通过rt-pcr验证这26个外源基因在转录水平均进行了正确的表达，进一步通过摇瓶发酵实验来检验其生成核黄素的能力，最终通过hplc质谱法测得其核黄素产量达到0.55g/l。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
22.图1、pbr326载体图谱；
23.图2、pyb889载体图谱；
24.图3、质粒转化图；
25.图4、pcr鉴定图；
26.图5、摇瓶发酵实验图；
27.图6、标准品质谱图；
28.图7、转化子发酵液质谱图。
具体实施方式
29.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
30.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
31.本发明实施例提供一种能表达生产核黄素的基因工程大肠杆菌构建方法，包括如下步骤：
32.对来自枯草芽孢杆菌的26个合成核黄素的基因进行结构优化，并化学合成，获得了优化后的26个基因；
33.具体的，选取枯草杆菌核黄素从头合成涉及26个基因bsglk1、bszwf1、bspgl、bsgnd、bsywlf、bsprs、bspurf、bspurd、bspurn、bspurl、bspurq、bspurs、bspurm、bspurk、bspure、bspurc、bspurb、bspurh、bsguaa、bsguab、bsgmpk、bsndk、bsriba、bsribb、bsribg和bsribh；
34.对应的序列号分别为：seq id no 1、seq id no 3、seq id no 5、seq id no7、seq id no 9、seq id no 11、seq id no 13、seq id no 15、seq id no 17、seq id no 19、seq id no 21、seq id no 23、seq id no 25、seq id no 27、seq id no 29、seq id no 31、seq id no 33、seq id no 35、seq id no 37、seq id no 39、seq id no 41、seq id no 43、seq id no 45、seq id no 47、seq id no 49、seq id no 51。
35.所述枯草芽孢杆菌的26个合成核黄素的基因按密码子偏好性进行结构优化；基因
36.化学合成遵循以下原则：优化基因密码子，提高基因翻译效率；消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建；消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的gc/at均衡，提高rna的稳定性；消除内含子识别序列，避免在编码区内发生内含子剪接，导致基因功能的丧失；rna的使基因编码蛋白符合n端原则(tobias 1991)，以提高翻译蛋白的稳定性；避免6个或更多的连续的a+t序列，5个或更多的g+c序列；避免2、3位用cg和ta双寡核苷酸，以上序列在植物中易造成甲基化，从而引起基因沉默；设计提高基因5’端的自由能，降低3’端的自由能，以提高基因翻译效率。
37.获得了优化后的26个基因为：bsglk1s、bszwf1 s、bspgls、bsgnds、bsywlfs、bsprss、bspurfs、bspurds、bspurns、bspurls、bspurqs、bspurss、bspurms、bspurks、bspures、bspurcs、bspurbs、bspurhs、bsguaas、bsguabs、bsgmpks、bsndks、bsribas、bsribbs、bsribgs和bsribhs；
38.其序列号分别对应为：seq id no 2、seq id no 4、seq id no 6、seq id no 8、seq id no 10、seq id no 12、seq id no 14、seq id no 16、seq id no 18、seq id no 20、seq id no 22、seq id no 24、seq id no 26、seq id no 28、seq id no 30、seq id no 32、seq id no 34、seq id no 36、seq id no 38、seq id no 40、seq id no 42、seq id no 44、seq id no 46、seq id no 48、seq id no 50、seq id no 52。
39.选择t7启动子和终止子控制所述优化后的26个基因的表达，完成优化后的26个基因原核表达单元的拼接；
40.具体的，t7噬菌体晚期转录系统是特殊的表达系统，也是目前用于表达外源基因的首选系统。其启动子为iii型启动子，大肠杆菌rna聚合酶无法识别，只能被噬菌体本身编码的t7 rna聚合酶(t7rnap)特异识别和调控；t7启动子是最强的原核启动子之一，高活性的t7 rnap合成mrna的速度比大肠杆菌rna聚合酶快5倍。本发明选择t7启动子和终止子控制以上26个化学合成基因的表达，分别进行大肠杆菌表达单元的拼接，插入t-载体。
41.构建了两个不同复制起点和抗性标记的质粒pbr326(pbr326载体图谱如图1所示)
42.和pyb8895(pyb8895载体图谱如图2所示)，在两个相容质粒基础上组装了核黄素
从头生物合成途径4大功能模块；
43.具体的，本发明实施例通过全基因化学合成技术获得了全长4523bp的质粒pyb8895，该质粒带有广宿主复制起点rep、接合型质粒“动员”的mob序列和用于细菌筛选的km抗性基因,质粒拷贝数在20左右；同时通过pcr技术扩增和体外重组获得了全长1860bp的质粒pbr326，该质粒带有pbr322 ori和ap抗性标记基因，拷贝数30左右。
44.本发明实施例基于pbr326和pyb8895两个相容质粒进行功能模块拼装，利用体外重组技术将核酮糖-5-磷酸生物合成模块(t7prpp)和次黄嘌呤核苷酸(imp)生物合成功能模块(t7bsimp)拼装入pyb326载体的ecori和hindiii之间，构成质粒pa6428；同时将gtp生物合成功能模块(t7bsgtp)和核黄素rib生物合成功能模块(t7bsrib)进行拼装入pyb8895载体的ecori和hindiii之间，构成的质粒为pa8101。将pa6428和pa8101同时转化染色体带有t7 rnap基因的大肠杆菌菌株，就获得了含有4个功能模块和26个基因原核表达单元的大肠杆菌从头合成核黄素的生物合成系统和工程菌株。
45.在完成表达单元构建的基础上，对4大功能模块[包括：核酮糖-5-磷酸生物合成、次黄嘌呤核苷酸(imp)生物合成、gtp生物合成和核黄素rib操纵子]包含的几个原核表达单元进行组装，产物插入t-载体，对以上4个功能模块进行克隆和核苷酸全序列分析。最终分别将以上4个组装成的核黄素生物合成功能模块定名为：t7prpp、t7bsimp、t7bsgtp和t7bsrib。
[0046]
将带有4大功能模块的双质粒转入带有t7rnap基因的大肠杆菌，获得了从头合成核黄素的含枯草杆菌26个基因原核表达单元的大肠杆菌工程菌株。对构建的大肠杆菌工程菌核黄素生物合成产量进行分析测定。
[0047]
上述构建方法还包括验证所转入的外源基因的完整性和表达，以及检验其生成核黄素的能力，采用rt-pcr验证其外源基因的完整性和表达，采用摇瓶发酵的实验进一步来检验其生成核黄素的能力。
[0048]
下面结合具体的实施例，进行详细的说明：
[0049]
实施案例1：
[0050]
对来自枯草芽孢杆菌的26个合成核黄素的基因进行结构优化，并化学合成，获得了优化后的26个基因：
[0051]
合成中使用的为南京诺唯赞生物科技有限公司(vazyme biotech co.,ltd)的适合长基因高保真扩增的phanta max super-fidelity dna polymerase。pcr扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性15s，56-72℃退火15s，72℃延伸30s-10min，扩增25-35个循环；72℃终延伸5min。
[0052]
其中，上述枯草芽孢杆菌的26个合成核黄素的基因即为野生型基因。
[0053]
基因化学合成遵循以下原则：优化基因密码子，提高基因翻译效率；消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建；消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的gc/at均衡，提高rna的稳定性；消除内含子识别序列，避免在编码区内发生内含子剪接，导致基因功能的丧失；rna的使基因编码蛋白符合n端原则(tobias 1991)，以提高翻译蛋白的稳定性；避免6个或更多的连续的a+t序列，5个或更多的g+c序列；避免2、3位用cg和ta双寡核苷酸，以上序列在植物中易造成甲基化，从而引起基因沉默；设计提高基因5’端的自由能，降低3’端的自由能，以提高基因翻译效率。
[0054]
实施案例2：
[0055]
拼接基因表达单元及组装功能模块
[0056]
优化结构后合成的以上26个基因原核表达单元的拼接采用改良重叠延伸pcr技术，该改良重叠延伸pcr技术具体参考文献：(rihe peng,aisheng xiong,quanhong yao；a direct and efficient page-mediated overlap extension pcr method for gene multiple-site mulagenesis,applied microbiology biotechnology.2006,73:234-40)，使用南京诺唯赞生物科技有限公司(vazyme biotech co.,ltd)的适合长基因高保真扩增的phanta max super-fidelity dna polymerase。pcr扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性45s，56-72℃退火45s，72℃延伸5-20min(根据片段长度)，扩增25-35个循环；72℃终延伸10min。
[0057]
随后分别将拼接的26个基因原核表达单元和日本takara公司的pmd18-st载体连接，将连接物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取大肠杆菌转化子进行液体培养，抽提质粒dna进行酶切鉴定，对鉴定正确的阳性质粒中的插入片段进行核苷酸全序列测定。最终获得序列完全正确的26个基因的原核表达单元。
[0058]
26个合成基因原核表达单元的名称分别定名为：：bsglk1 s、bszwf1 s、bspgls、bsgnds、bsywlfs、bsprss、bspurfs、bspurds、bspurns、bspurls、bspurqs、bspurss、bspurms、bspurks、bspures、bspurcs、bspurbs、bspurhs、bsguaas、bsguabs、bsgmpks、bsndks、bsribas、bsribbs、bsribgs和bsribhs；
[0059]
其序列号分别对应为：seq id no 2、seq id no 4、seq id no 6、seq id no 8、seq id no 10、seq id no 12、seq id no 14、seq id no 16、seq id no 18、seq id no 20、seq id no 22、seq id no 24、seq id no 26、seq id no 28、seq id no 30、seq id no 32、seq id no 34、seq id no 36、seq id no 38、seq id no 40、seq id no 42、seq id no 44、seq id no 46、seq id no 48、seq id no 50、seq id no 52。
[0060]
各个核黄素生物合成功能模块的组装同样采用改良重叠延伸pcr技术。使用南京诺唯赞生物科技有限公司(vazyme biotech co.,ltd)的适合长基因高保真扩增的phanta max super-fidelity dna polymerase。pcr扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性45s，56-72℃退火45s，72℃延伸5-20min(根据片段长度)，扩增25-35个循环；72℃终延伸5min。
[0061]
分别将组装的4个功能模块dna长片段和日本takara公司的pmd18-st载体连接，将连接物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取大肠杆菌转化子进行液体培养，抽提质粒dna进行酶切鉴定，将阳性质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序，保证测序结果和设计序列完全一致，最终获得序列完全正确的4个功能模块，每个功能模块两端均带有ecori和hindiii切点。
[0062]
实施案例3
[0063]
大肠杆菌相容性载体构建
[0064]
本发明实施例在两个相容性质粒上构建整个枯草杆菌核黄素生物合成系统，我们选择pbr322 ori和广宿主pbbr1mcs质粒ori的两种载体。首先，以毕赤酵母ppic9k载体【genbank no:z46234】为模板，设计并合成一对pcr扩增引物：
[0065]
r47312:5
’‑
aag,ctt,acc,gaa,ttc,atg,gtt,tct,tag,acg,tca,ggt-3’)和r47313:(5
’‑
gaa,tt c,ggt,aag,ct t,gga,taa,cgc,agg,aaa,gaa,cat,g-3’)进行pcr扩
增,引物阴影部分为同源区，扩增程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环；最后72℃延伸10min。经1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收pcr产物，产物经通用生物系统(安徽)有限公司genrec assembly master mix kit进行重组环化，50℃保温15-60min后放入冰浴5min,随后-20℃保存。需要时解冻转化大肠杆菌dh5α，ecori单酶切鉴定阳性克隆，委托生工生物工程(上海)有限公司对阳性质粒进行测序，测序结果和原先序列完全相同，将该质粒定名为pbr326，该质粒长度仅1860bp,带有pbr322 ori和ap抗性标记基因，具有较高的拷贝数(30左右)，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组质粒dna制备提供了方便。
[0066]
实施案例4
[0067]
在大肠杆菌相容性载体上构建核黄素生物合成系统
[0068]
首先分别对核酮糖-5-磷酸生物合成模块(t7prpp)和次黄嘌呤核苷酸(imp)生物合成功能模块(t7bsimp)进行长引物pcr扩增，使用通用生物系统(安徽)有限公司genrec assembly master mix kit，将带有24bp重叠区的两个pcr扩增产物经体外重组插入pyb326载体的ecori和hindiii之间，重组产物转化大肠杆菌dh5α,抽提质粒，经ecori和hindiii双酶切鉴定，获得阳性克隆，委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序，测序结果和设计序列完全一致,最终构成的质粒定名为pa6428。
[0069]
分别对gtp生物合成功能模块(t7bsgtp)和核黄素rib生物合成功能模块(t7bsrib)进行长引物pcr扩增，使用通用生物系统(安徽)有限公司genrec assembly master mix kit，将带有24bp重叠区的两个pcr扩增产物经体外重组插入pyb8895载体的ecori和hindiii之间，重组产物转化大肠杆菌dh5α,抽提质粒，经ecori和hindiii双酶切鉴定，获得阳性克隆，委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序，测序结果和设计序列完全一致，最终构成的质粒定名为pa8101。
[0070]
随后将这两个质粒同时转化美国invitrogen公司的bl21-ai(cat no.6070-03)[f’ompt hsdsb(rb-mb-)gal dcm arab::t7rnap-teta](命名eg61)大肠杆菌感受态，在lb+km+ap固体平板筛选双质粒转化子，37℃，培养12h后观察菌株生长情况，如图3所示。从图上可以很明显的看出培养基中有淡黄色，初步说明有核黄素的生物合成和分泌。
[0071]
实施案例5
[0072]
进一步验证所转入的外源基因的完整性和表达，以及检验其生成核黄素的能力。
[0073]
接下来为了进一步验证所转入的外源基因的完整性，分别设计了26对引物对所转入的26个基因进行了rt-pcr验证。所设计的引物序列如下：
[0074]
1.r50580＝bsglksz1:tm＝60,ggt,ctg,gtg,ctg,ggt,aat,ctg和
[0075]
2.r50581＝bsglksf1:tm＝60,gca,gtt,ctg,atg,ctt,cag,cca。产物：237bp。
[0076]
3.r50582＝bszwf1sz1:tm＝60,ctg,aac,act,cct,gaa,gca,tac和
[0077]
4.r50583＝bszwf1sf1:tm＝60,gtt,cca,cca,atg,cag,acc,atc。产物：225bp
[0078]
5.r50584＝bspglsz1:tm＝60,gtg,ttc,gaa,gtg,aac,cag,tac
[0079]
6.r50585＝bspglsf1:tm＝60,cac,ttg,atg,cag,gaa,ctt,cac。产物：237bp
[0080]
7.r50586＝bsgndsz1:tm＝60,atc,gca,cca,tac,ttc,act,gac和
[0081]
8.r50587＝bsgndsf1:tm＝60,aga,cca,gtt,agt,atg,gaa,cac。产物：237bp
[0082]
9.r50588＝bsywlfsz1:tm＝60,tgt,ggt,act,ggt,atc,ggt,atg和
[0083]
10.r50589＝bsywlfsf1:tm＝60,acc,gat,acg,agt,ctg,atg,acg。产物：222bp
[0084]
11.r50590＝bsprssz1:tm＝60,gag,aac,ggt,gct,aag,gaa,gtg和
[0085]
12.r50591＝bsprssf1:tm＝60,aga,ctg,ctg,ttc,atg,aac,acg。产物：210bp
[0086]
13.r50592＝bspurfsz1:tm＝60,act,cat,gaa,gaa,ctg,atc,gca和
[0087]
14.r50593＝bspurfsf1:tm＝60,agt,cag,cac,agc,ctc,ctt,cac。产物：225bp
[0088]
15.r50594＝bspurdsz1:tm＝60,act,cct,atc,ggt,tca,ctt,gct和
[0089]
16.r50595＝bspurdsf1:tm＝60,ctg,tgc,agc,ctt,cag,tgc,acg。产物：4740bp
[0090]
17.r50596＝bspurnsz1:tm＝60,aac,atc,cat,cca,tca,ctt,ctg和
[0091]
18.r50597＝bspurnsf1:tm＝60,acg,gtt,gtt,caa,acc,caa,cag。产物：234bp
[0092]
19.r50598＝bspurlsz1:tm＝60,gag,aac,ctt,ggt,gct,aac,gtg和
[0093]
20.r50599＝bspurlsf1:tm＝60,tgc,ctt,tga,ctt,cag,cag,gca。产物：267bp
[0094]
21.r50600＝bspurqsz1:tm＝60,act,atc,cct,gtt,gca,cat,ggt和
[0095]
22.r50601＝bspurqsf1:tm＝60,tgc,agt,agt,cac,atg,agt,ctc。产物：273bp
[0096]
23.r50602＝bspurssz1:tm＝60,aag,gtg,aag,gtg,tat,gtg,tca和
[0097]
24.r50603＝bspurssf1:tm＝60,ctg,tgc,cac,aac,ctc,ctc,cac。产物：246bp
[0098]
25.r50604＝bspurmsz1:tm＝60,cca,cgt,atg,ctg,cct,gaa,ggt和
[0099]
26.r50605＝bspurmsf1:tm＝60,tgc,agc,acc,acc,gaa,agt,cac。产物：264bp
[0100]
27.r50606＝bspurksz1:tm＝60,gaa,cag,cat,atc,cgt,gct,gtg和
[0101]
28.r50607＝bspurksf1:tm＝60,ctc,agc,ttg,acc,acc,atc,acg。产物：270b
[0102]
29.r50608＝bspuresz1:tm＝60,ggt,ggt,gct,gca,cat,ctt,cct和
[0103]
30.r50609＝bspuresf1:tm＝60,gaa,tca,tct,gac,cag,ctt,gtg。产物：291bp
[0104]
31.r50610＝bspurcsz1:tm＝60,gca,act,cct,gaa,cag,gtg,gag和
[0105]
32.r50611＝bspurcsf1:tm＝60,atg,atg,gat,acc,acc,cag,acg。产物：288bp
[0106]
33.r50612＝bspurbsz1:tm＝60,gag,aac,atg,aag,cgt,aac,atg和
[0107]
34.r50613＝bspurbsf1:tm＝60,acc,caa,acg,ttc,gaa,gat,cag。产物：273bp
[0108]
35.r50614＝bspurhsz1:tm＝60,gtg,gtg,aag,cat,gtg,aag,tca和
[0109]
36.r50615＝bspurhsf1:tm＝60,atg,ctt,gaa,atg,acg,gat,acc。产物：312bp
[0110]
37.r50616＝bsguaasz1:tm＝60,gag,atc,gca,aat,cat,ggt,ctg和
[0111]
38.r50617＝bsguaasf1:tm＝60,ctc,cca,ctc,gat,agt,tgc,agg。产物：273bp
[0112]
39.r50618＝bsguabsz1:tm＝60,cgt,ggt,atg,ggt,tct,gtt,gct和
[0113]
40.r50619＝bsguabsf1:tm＝60,gat,agt,gta,gtt,agg,tga,ctc。产物：297bp
[0114]
41.r50620＝bsgmpksz1:tm＝60,gca,ttc,cct,gag,ggt,ctg,ttc和
[0115]
42.r50621＝bsgmpksf1:tm＝60,ctc,cag,cat,ctt,ctt,gta,acg。产物：267bp
[0116]
43.r50622＝bsndksz1:tm＝60,ggt,gaa,ctg,gtt,gag,ttc,atc和
[0117]
44.r50623＝bsndksf1:tm＝60,cat,cag,ctg,ctg,gta,tga,cac。产物：255bp
[0118]
45.r50624＝bsribasz1:tm＝60,gag,ggt,cgt,ggt,atc,ggt,ctg和
[0119]
46.r50625＝bsribasf1:tm＝60,gaa,atg,cag,cag,atg,acc,cag。产物：315bp
[0120]
47.r50626＝bsribbsz1:tm＝60,aag,tct,aac,gct,gtg,tac,tac和
[0121]
48.r50627＝bsribbsf1:tm＝60,acc,gtt,ctc,aga,caa,gaa,tgc。产物：303bp
[0122]
49.r50628＝bsribgsz1:tm＝60,cgt,ctg,tct,gca,ttc,ggt,gtg和
[0123]
50.r50629＝bsribgsf1:tm＝60,ctt,agt,tgg,ctt,agc,agt,cag。产物：321bp
[0124]
51.r50630＝bsribhsz1:tm＝60,atg,gct,gag,act,aag,aag,tac和
[0125]
52.r50631＝bsribhsf1:tm＝60,gaa,tga,acg,att,cag,gtt,agc。产物：264bp
[0126]
大肠杆菌转化子的rna抽提参照《分子克隆实验指南》。之后采用takara rna反转录试剂盒获得cdna。然后以cdna作为模板，进行rt-pcr扩增。反应体系：1μl质粒，4μl 2.5mmol/l dntps，5μl buffer，ex-taq(toyobo日本)0.5u，引物各1μl，加ddh2o至50μl；反应程序为：94℃30s，54℃30s，72℃30s，共45个循环，72℃再延伸10min，凝胶电泳拍照(图4)。证实所转入的外源基因在转录水平均进行了正确的表达。
[0127]
为了进一步验证核黄素的生物合成，从上述转化的平板上的浅黄色培养基(图3)可以推断出可能有核黄素的生物合成，我们挑取转化子单菌落接种到发酵培养基中，发酵培养基：葡萄糖糖40g/l，酵母粉10g/l，胰蛋白胨10g/l，磷酸二氢钾13.5g/l，七水硫酸镁2g/l，氯化钠2g/l，氯化钠2g/l，柠檬酸2g/l，5ml 200
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微量元素，调节ph＝7；摇床转速：220rpm，温度：37℃，发酵12h，取样进行hplc质谱检测,质谱检测参考段云霞等方法(段云霞.产核黄素工程菌b.subtilis py的代谢工程研究[d].天津大学,2007)。结果见图5、图6、图7，最终测得该工程菌株能产生大约0.55g/l的核黄素。
[0128]
以上描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。